Hey1 gene expression patterns during the development of branchial arches and facial prominences / Patrones de expresión del gen Hey1 durante el desarrollo de arcos branquiales y prominencias faciales

ABSTRACT Objective. The present study aimed to describe in detail the expression patterns of the gene Hey1, an effector of the Notch pathway, during the development of branchial arches and facial prominences. Materials and methods. Fertilized chicken (Gallus gallus) eggs obtained from a local egg farm were incubated at 37.5 -38.5ºC with 70% relative humidity until the embryos reached Hamilton-Hamburger stages HH14 through HH25. Digoxigenin-UTP labeled probes Hey1 were generated from linearized plasmids with either T3 polimerase for in vitro transcription. Whole-mount in situ hybridization was then performed. At least 3 replicates (n=3) were obtained for each stage. To confirm the results observed in whole embryos, sagittal and coronal cryosectioning was performed using a thickness of 10 µm. Results. During developmental stages HH14 and HH18, Hey1 gene expression was localized to the endoderm of branchial pouches. Hey1 gene expression was also observed in the epithelium that covers the maxillary and mandibular prominences during developmental stages HH19 and HH21, as well as in the nasal epithelium between HH19 and HH25. Transcripts were also detected in the epithelium that covers the frontonasal prominence during stage HH21. Conclusions. These expression patterns suggest the participation of this component of the Notch signaling pathway in craniofacial morphogenesis, possibly establishing pharyngeal segmentation patterns during early stages and/or regulating cell proliferation and differentiation during the late stages of facial development.

RESUMEN Objetivo. El presente estudio tuvo como objetivo describir detalladamente los patrones de expresión del gen Hey1, un efector de la vía Notch durante el desarrollo de arcos branquiales y prominencias faciales. Materiales y métodos. Se incubaron huevos fertilizados de pollo (Gallus gallus) obtenidos de una granja local entre 37.5-38.5ºC con humedad relativa del 70% hasta que los embriones alcanzaron los estadios HH14 hasta HH25 de Hamilton-Hamburger. Las sondas Hey1 marcadas con digoxigenina-UTP se generaron a partir de plásmidos linearizados con T3 polimerasa por transcripción in vitro. Luego se realizó hibridación in situ sobre embriones completos. Se obtuvieron al menos 3 repeticiones (n=3) para cada estadio. Para confirmar los resultados observados en embriones completos, se realizaron cortes sagitales y coronales de 10 µm. Resultados. Durante los estadios de desarrollo HH14 y HH18, la expresión del gen Hey1 se localizó en el endodermo de las bolsas branquiales. La expresión génica de Hey1 también se observó en el epitelio que cubre las prominencias maxilares y mandibulares durante las etapas de desarrollo HH19 y HH21, así como en el epitelio nasal entre HH19 y HH25. También se detectaron transcritos de Hey1 en el epitelio que cubre la prominencia frontonasal durante la etapa HH21. Conclusiones. Estos patrones de expresión sugieren la participación de este componente de la vía de señalización Notch en la morfogénesis craneofacial, posiblemente estableciendo patrones de segmentación faríngea durante las primeras etapas y / o regulando la proliferación y diferenciación celular durante las últimas etapas del desarrollo facial.

EXPRESIÓN DE LOS GENES Serrate1 Y Notch1 DURANTE EL DESARROLLO DEL TERCIO MEDIO FACIAL DEL EMBRIÓN DE POLLO / Expression of Serrate1 and Notch1 Genes During Chicken Embryo Midface Development

La via de senalización Notch se caracteriza por mediar la comunicación célula-célula, regulando diferentes procesos celulares como proliferación, apoptosis y definición del destino celular. Esta via ha sido implicada en el desarrollo de estructuras craneofaciales como paladar, diente y bóveda craneal. El objetivo de esta investigación fue identificar los patrones de expresión de los genes componentes de la via Notch, Serrate1 y Notch1, durante el desarrollo del tercio medio facial. Se utilizaron embriones de pollo (Callus gallus) seleccionados de acuerdo a los criterios de Hamilton y Hamburger y sobre los cuales se realizó hibridación in situ con ribosondas marcadas con Digoxigenina (DIG), para luego ser detectadas con anticuerpos Anti-Dig. Los resultados mostraron expresión de los genes evaluados, en las prominencias maxilares (pmx) y frontonasal (pfn) durante el desarrollo del tercio medio facial. Estos resultados sugieren una probable participación de la via Notch a través de estos genes, en los diferentes procesos celulares que determinan la morfogénesis y el desarrollo del tercio medio facial.

The Notch signaling pathway is characterized by mediate cell-cell communication, regulating different cellular processes as proliferation, apoptosis and cell fate definition. This pathway has been implicated in craniofacial structures development as palate, teeth and cranial vault. The objective of this research was to identify the genes expression patterns of some Notch signaling pathway components, Serrate1 and Notch1, during the midface development. It was used chicken embryos (Callus gallus) selected according to Hamilton and Hamburger criteria. We performed in situ hybridization with Digoxigenin (DIG)-labeled riboprobes and detected with the antibody Anti-Dig. The results showed the expression of the evaluated genes in the maxillary (pmx) and frontonasal (pfn) prominences during the midface development. These results suggest a probable involvement of the Notch pathway through these genes in different cellular processes that determine midface morphogenesis and development.

Variación de patrones morfológicos craneofaciales en relaciones esqueléticas Clase I, II y III / Variation of craniofacial morphological patterns in Class I, II, and III skeletal relationships

Introducción: tradicionalmente, los estudios de variaciones morfológicas de componentes craneofaciales para clasificar relaciones esqueléticas han considerado análisis univariados y multivariados mediante variables como distancias, ángulos y planos referenciales. Sin embargo, estos métodos no explican cambios generales de forma y proporcionan una descripción parcial y localizada de estas relaciones. En tanto, los métodos basados en Morfometría Geométrica (MG) en dos o tres dimensiones (2D o 3D,) permiten una comprensión detallada y un examen más sensible de variables. El objetivo fue identificar la variación de patrones morfológicos de la estructura CraneofacialGeneral(CFG) en relaciones esqueléticas I, II y III, utilizando MG-2D. Métodos: se hizo un estudio prospectivo mediante muestreo no probabilístico. Se tomaron 272 radiografías laterales de cráneo (140 hombres/132 mujeres) de individuos colombianos entre 17 y 25 años, y se determinó el error intraexaminador considerando la prueba F-ANOVA como estadístico de prueba. Se hizo Análisis Generalizado de Procrustes (AGP) y detección de datos atípicos por Cuantil Adaptativo. La variación en tamaño se analizó con prueba Kruskal-Wallis, considerando la matriz de Tamaño Centroide (CS) y las diferencias conformacionales con MANOVA. La identificación de patrones craneofaciales se determinó mediante Análisis de Componentes Principales (ACP) y Conglomerados/K-medias. Resultados: en la estructura CFG se encontraron diferencias conformacionales y una capacidad de buena clasificación del 89% (Clase I), 89% (Clase II) y 91% (Clase III). Se identificaron cuatro patrones craneofaciales; tres evidenciaron relaciones esqueléticas clásicas, y el otro identificó un nuevo grupo combinado de Clase I/II. Conclusiones: las diferencias morfológicas en los cuatro patrones identificados fueron evidentes, la MG permitió una visualización explicativa de patrones de variación morfológica, localizando sitios reales en donde ocurren cambios en tamaño y conformación.

Introduction: the studies on morphological variations of craniofacial components to classify skeletal relationships have traditionally included univariate and multivariate analysis using variables such as distances, angles, and reference planes. However, these methods fail to explain general changes in shape and provide partial localized descriptions of these relationships. Whereas methods using two- or threedimensional (2D or 3D) Geometric Morphometrics (GM) allow a detailed understanding and a more sensitive test of variables. The objective of this study was to identify morphological pattern variations of the Overall Craniofacial Structure (OCS) in skeletal relationships I, II, and III using GM-2D. Methods: this was a prospective study using non-probability sampling. It implied taking 272 lateral radiographs of the head of Colombian individuals (140 males/132 females) aged 17 to 25 years, determining intra-examiner error and using F-ANOVA as statistic test. Generalized Procrustes Analysis (GPA) was conducted as well as atypical data detection by Adaptive Quantile. Size variation was analyzed by the Kruskal-Wallis test considering Centroid Size matrix (CS) and conformational differences were analyzed with MANOVA. Craniofacial patterns were identified by Principal Components Analysis (PCA) and K-means/cluster. Results: the OCS showed conformational differences and a good classification capacity of 89% (Class I), 89% (Class II), and 91% (Class III). Four craniofacial patterns were identified; three of them showed typical skeletal relationships and the other pointed out to a new Class I/II combined group. Conclusions: the morphological differences in the four identified patterns were evident; GM allowed an explanatory display of morphological variation patterns, identifying actual sites where changes in size and shape take place.

Curvas de crecimiento del perímetro cefálico en niños de 0 a 3 años: una nueva aproximación / Head circumference growth curves in children 0 to 3 years of age: a new approach

Introducción: el perímetro cefálico es un indicador de salud y de crecimiento global craneal en la primera infancia, por lo que debe monitorearse. Usualmente, los patrones de referencia OMS utilizan el modelo Box Cox Power exponential y el método LMS para modelar el comportamiento del crecimiento del perímetro cefálico. Estos métodos tienen la debilidad de comparar cada individuo frente a una mediana poblacional, lo cual no permite caracterizar el crecimiento individual; en tanto que al usar los modelos longitudinales de efectos mixtos se puede evaluar el patrón individual de crecimiento y controlar la variabilidad entre sujetos. El objetivo fue hacer uso de los modelos longitudinales de efectos mixtos, caracterizar los patrones de crecimiento a partir del perímetro cefálico en niños de 0 a 3 años. Métodos: siendo éste un estudio longitudinal prospectivo, los criterios de elegibilidad para los niños obedecieron a factores de inclusión y exclusión (OMS); 265 niños colombianos (116 niñas, 149 niños), residentes en Bogotá, fueron distribuidos en 3 grupos G1: (0-12], G2: (12–24], G3: (24–36] meses. Se midieron cada 3 meses durante 1 año. Dos examinadores tuvieron entrenamiento y continua estandarización, monitoreo de adherencia a procedimientos de recolección y calidad de datos. Se calculó el error aleatorio y sistemático. Las curvas de crecimiento fueron construidas usando los modelos longitudinales mixtos. Para la estimación del modelo se utilizó el método de estimación de máxima verosimilitud restringida (REML), software estadístico R versión libre 2.15. Para el ajuste de los modelos el paquete lme4. Resultados: se ajustaron 6 modelos, observándose mayor pendiente de crecimiento de 0-12 meses. Conclusiones: la metodología utilizada permitió entender el comportamiento del perímetro cefálico por grupo, edad y sexo, y analizar datos con estructuras de desbalance.

Introduction: head circumference is an indicator of health and global cranial growth in early childhood, so it must be monitored. Usually, the WHO reference patterns use the Box Cox Power exponential model and the LMS method to model the behavior of head circumference growth. These methods are limited because they compare each individual against the median of a population, which prevents characterizing individual growth, while mixed-effect longitudinal models allow assessing individual growth patterns and controlling variability among subjects. The objective of this study was to use mixed-effect longitudinal models to characterize growth patterns based on head circumference in children 0 to 3 years of age. Methods: being a prospective longitudinal study, the criteria for children eligibility considered inclusion and exclusion factors (WHO); 265 Colombian children (116 girls, 149 boys) living in Bogotá were distributed in 3 groups: G1: (0-12], G2: (12-24], G3: (24-36] months. They were measured every 3 months for 1 year. Two examiners were trained and continuously standardized, and they were monitored on adherence to data quality and data collection procedures. Random and systematic errors were calculated. Growth curves were constructed using mixed longitudinal models. The model was estimated through the method of estimation of restricted maximum likelihood (REML), free R statistical software, version 2.15. To adjust the models, we used the lme4 package. Results: 6 models were adjusted, with maximum gradient of growth from 0 to 12 months. Conclusions: this methodology allowed understanding the behavior of head circumference by age group and sex, and analyzing data with unbalanced structures.

Prevalencia y caracterización de los recién nacidos con anomalías craneofaciales en el Instituto Materno Infantil de Bogotá / Prevalence and characterisation of the newborn suffering craniofacial anomalies at the Instituto Materno Infantil in Bogotá

Objetivos Determinar la frecuencia y caracterizar los neonatos nacidos con anomalías craneofaciales atendidos en el Instituto Materno Infantil (IMI). Métodos Se recolectaron los datos de nacidos o remitidos al IMI, estrato, procedencia, factores de riesgo general y específico, género, edad gestacional, correlación peso y edad gestacional, diagnóstico de la anomalía, cariotipo y condición al egreso de los neonatos con anomalías craneofaciales atendidos entre 1 de Marzo de 2000 y 15 de Agosto de 2001. Resultados La prevalencia de anomalía congénita fue 2,7 por ciento y de anomalía craneofacial 0,6 por ciento. De 52 pacientes, 69 por ciento tenía factores de riesgo específico, 38 por ciento era prematuro y 33 por ciento tenía retardo del crecimiento intrauterino; 65 por ciento correspondió a hendiduras, 55,8 por ciento a anomalía múltiple y 46 por ciento a síndromes. Se estableció diagnóstico etiológico en 38 por ciento de los casos; 12 por ciento tenía cromosomopatía. Fallecieron 18 niños (35 por ciento) y en 13 la muerte se atribuyó a la anomalía, 6 de éstos tenían cromosomopatía. Se evidenció la utilidad del cariotipo para hacer diagnóstico etiológico y establecer pronóstico. Los neonatos con anomalías craneofaciales tuvieron 3 veces más riesgo de morir que el resto de neonatos hospitalizados. Se demostró asociación estadísticamente significativa de la mortalidad con prematurez, retardo de crecimiento, cromosomopatía y diagnósticos de anomalía múltiple y síndrome. Conclusiones Prematurez, retardo de crecimiento, anomalía múltiple, diagnóstico de síndrome y cromosomopatía evidencian un perfil de riesgo para mortalidad.

Objectives Determining the frequency and characteristics of newborn suffering craniofacial abnormalities who were attending the Instituto Materno Infantil (IMI) in Bogotá. Methods Data was gathered regarding the newborn suffering such alterations who attended IMI from March 1 st 2000 to August 15 th 2001. The variables analysed were: being born in or having been remitted to the IMI, social strata, origin, general and specific risk factors, gender, correlation between weight and gestational age, clinical and aetiological diagnosis of the anomaly, karyotype and condition on leaving IMI. Results There was 2,7 percent prevalence for congenital defects and 0,6 percent for craniofacial abnormalities. 69 percent of the 52 patients had specific risk factors, 38 percent had been preterm, 33 percent had suffered retarded intra-uterine growth, 65 percent had cleft palates, 55,8 percent multiple abnormalities and 46 percent syndromes. Aetiological diagnosis was established in 38 percent; 12 percent had chromosomopathy. Eighteen children (35 percent) died, death being attributed to their defect in 13 of them, six by chromosomopathy. This study revealed the use of karyotype in making an aetiological diagnosis and determining prognosis. Mortality for the group suffering craniofacial abnormalities was threefold that of other hospitalised neonatal patients. Significant statistical association was shown between mortality and preterm condition, retarded growth, chromosomopathy and a diagnosis of multiple defects and/or syndromes. Conclusions Prematurity, retarded growth, multiple defects, syndrome diagnosis and chromosomopathy revealed a mortality risk profile.